血清脂蛋白电泳原理和操作方法

目前在临床应用中,血清脂蛋白的作用还是比较大的,所以对于许多患者,想要全面了解血清脂蛋白电泳的原理及操作方法,为了您能尽快地了解,以下是对您的详细介绍,您可以多了解一下,相信以后会对您有所帮助的。

原则在碱性pH条件下,以琼脂糖凝胶或醋酸纤维条带为载体,从阳性方向分离出脂蛋白。所形成的蛋白质条带可用脂染染色,如苏丹黑或油红,它们仅用于脂蛋白染色。另外,还可以在琼脂中添加聚阴离子和二价阳离子。血脂沉淀带用光密度仪可以立即进行定量分析。还可在脂肪分解后再溶解脂肪带,用直接酶法测定各区带中的胆固醇浓度。此外,用薄层琼脂糖凝胶电泳分离后,可以直接测定各组分的胆固醇含量,从而为进一步研究提供了一种新方法。

运行方法(1)在电泳槽中添加缓冲液,调整两边槽中的缓冲液,使其在同一水平面上。

准备醋酸纤维素薄膜:将醋酸纤维素薄膜(2cm×8

cm)在毛面的一端(负极)1.5

cm处,用铅笔轻轻画一条线,作点状标记。编码,并标明正负极后,将薄膜放入巴比妥-巴比妥钠缓冲液中浸泡,等其完全浸透(一般为20min)取出,夹在清洁滤纸中间,将多余的缓冲液吸出。

(3)把醋酸纤维素薄膜的毛面贴在电泳槽的托架上拉直。以吸管吸取无溶血清样3~5μl,在横线处沿横线加样,样品应与膜边保持一定距离,以免在电泳图谱的蛋白区域发生变形,在血清渗入膜后,反相薄膜,使光面朝上,平直贴在电泳槽支架上,用双层滤纸或四层纱布将膜的两端与缓冲液相接,稍等片刻。

(4)接通电源,注意醋酸纤维薄膜上的正负两个极点,不要误接。电压90~150V,电流0.4~0.6mA/cm(不同电泳仪对电压要求不同,电流可能不一样,要灵活掌握),夏季通电45min,冬季通电稍长,大约60min左右,冬季通电,电泳区延伸约25~35mm左右。

(5)染色:通电后,取下染色膜,直接浸入丽春红S染液或氨黑10B染液中,染色5~10min(以白蛋白区带为染色剂),然后将残留染料漂去,直至底色为无色。

(6)数量:1比色法:将漂洗后的膜吸干,剪下各染色蛋白带,送进相应的试管,加0.4mol/L氢氧化钠6ml(计算吸光率乘以2),其余各管加3ml,振摇后放入37℃水瓶20min,使颜色浸入。氨黑10B染色用分光光度计测定620nm处的每个管吸光度,然后计算每个管吸光度(同时作空白管对照)。

当丽春红S染色时,采用0.1mol/L氢氧化钠浸出剂,加入量与上法相同。在10min后,白蛋白管内加400ml/L醋酸0.6ml(计算吸光度时乘2),其余各管加0.3ml,中和部分氢氧化钠,使其颜色变深,如有需要,离心,取清液处用分光光度计读取每个管的吸光度(并作空白对照),然后计算其含量。

㈡光密度计扫描:A.透明:吸收薄膜上的漂洗液(为防止透明液被稀释而影响透明效果),将薄膜浸入2~3min透明液,然后取出,滚动地将其平放在干净、无划痕的载体玻璃上(不要产生气泡),将该玻片竖直片刻,除去多余的透明液后,置于恒温90~100℃烘箱中,烘烤10~15min,取出,冷却到室温,使其透明,并使其有一层膜平整,可用于直接扫描和永久保存(采用氢萘或液体石蜡透明,应在清洗过的薄膜上保持透明,此法透明的薄膜不会有任何皱褶)。②扫描定量:将透明膜置于全自动光密度计或其它光密度计的暗箱中,用来进行扫描分析。